复发性流产发生率为1%~5%,其中40%~60%原因不明,称为不明原因复发性流产(unexplainedrecurrentspontaneousabortion,URSA)。近年研究表明,URSA的发生与免疫失衡关系密切,又称为同种免疫型复发性流产。本文论述URSA免疫学的发病机制、诊断、治疗的最新研究进展,重点论述了发病机制中免疫失衡方面的研究进展。不明原因复发性流产(URSA);机制;细胞因子;治疗

复发性流产(RSA)是指2次及2次以上的自然流产,病因多而复杂,其中半数病因不清,称为不明原因复发性流产(URSA)。对于已知病因的RSA,可以通过手术、药物等针对病因的治疗,但是对于不明原因复发性流产患者(URP)的诊治方面存在很大争议,给患者及临床医师带来极大的困扰。近年研究表明,URSA的发生与免疫失衡关系密切,纠正免疫异常可降低流产率。本文论述URSA免疫学的发病机制、诊断、治疗的最新研究进展。1诊断

URSA的诊断至今缺乏特异性检测指标,其方法是排除诊断。年的RSA诊治的专家共识中将同种免疫型RSA称为URSA,同种免疫型RSA包括:①固有免疫紊乱:包括自然杀伤(NK)细胞数量及活性升高、巨噬细胞功能异常、树突状细胞功能异常、补体系统异常等;②获得性免疫紊乱:包括封闭抗体缺乏、T、B淋巴细胞异常、辅助性T淋巴细胞Th1/Th2细胞因子异常等。

2发病机制随着现代免疫学的进展,妊娠被认为是成功的同种异体移植,胎儿免受母体免疫系统的攻击是胎儿存活的关键因素。免疫细胞与细胞因子构成免疫网络,子宫内膜与蜕膜中的免疫细胞种类及数量与外周血有很大不同。子宫内膜及蜕膜中免疫细胞主要由NK细胞、T细胞和巨噬细胞构成,以下我们主要从这3种细胞及其分泌的细胞因子来分析。2.1NK细胞

NK细胞是固有免疫的组成细胞之一,外周血与子宫内膜、蜕膜中均含有NK细胞,近年的研究表明,NK细胞的数量、亚群比例、毒性、分泌的细胞因子、受体及基因表达的异常与URSA相关。

外周血NK(peripheralbloodNK,pNK)细胞占淋巴细胞的5%~10%,外周血NK细胞大部分表达CD56dimCD16+,主要功能是杀伤病毒感染的细胞和突变的肿瘤细胞。pNK细胞受年龄、种族、性别等影响,一直以来,pNK细胞与URSA的关系一直存在争议。部分研究认为,URSA中非孕期活化的pNK细胞比例升高,但另有研究认为,URSA的pNK细胞数量与正常女性并无明显差异。且一些研究试图将pNK细胞的数量和活性作为URSA下次妊娠结局的预测指标,但年的一篇系统回顾表明,在URSA中孕前pNK的数目增多和活性增高不能预测流产。pNK细胞的数目也受应激反应的影响,研究表明抽血引起的应激反应也会导致实验误差。

NK细胞占子宫淋巴细胞的70%~90%,子宫NK(uterinenaturalkiller,uNK)细胞大部分表达CD56brightCD16-,CD56brightCD16-NK细胞基本上无细胞毒性,其主要的作用为分泌免疫调节细胞因子及血管调节因子,分泌白介素(IL)-10的数量是CD56dimCD16+NK细胞的25倍,还可分泌干扰素(IFN)-g、肿瘤坏死因子(TNF)-a、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、转化生长因子(TGF)-b、IL-6、IL-8、IL-10及血管生成素-1、血管生成素-2、血管内皮生长因子(VEGF)-C、胎盘生成因子等,调控滋养层细胞的入侵,参与子宫螺旋动脉的重塑。有研究证明,uNK细胞缺失的鼠流产率明显增加。另有研究表明URSA非孕期的子宫内膜uNK细胞数目较正常人群明显增高。

由于各项研究中对研究对象的纳入标准不同,pNK细胞、uNK细胞正常值指标的选取不同,采取的实验方法不同,其结果各不相同,并且目前严格的随机对照试验过少,对于URSA的uNK细胞、pNK细胞变化尚不明确,需要更多的严谨的研究。2.2T细胞

CD3+T细胞在子宫内膜和蜕膜淋巴细胞中含量仅次于uNK细胞,一些研究表明URSA患者外周血CD3+T细胞与正常非孕女性无统计学差异,自然流产患者蜕膜中CD3+T细胞的比例与正常妊娠患者蜕膜无统计学差异。随着研究的进展,对CD3+T细胞的分类研究越来越深入,根据CD3+T细胞表面表达分子的不同分为CD8+T细胞、CD4+T细胞、Treg细胞,CD4+T细胞中不同亚群细胞分泌的细胞因子不同,将CD4+T细胞分为Th1、Th2、Th17、Treg细胞。不同的T细胞亚群在免疫应答中发挥不同的作用,研究表明,Th1/Th2/Th17/Treg比例的失衡影响母-胎免疫耐受,是URSA的原因之一。2.2.1Th1细胞

Th1分泌IL-1、IL-2、IL-12、TNF-a、TNF-b、IFN-g等细胞因子。早期适量的Th1因子有利于滋养细胞形成,并在着床期促进血管生成。但Th1类细胞因子也为促炎性细胞因子,过度及过时表达均对胚胎的存活有不利影响。一方面通过激活T毒性细胞、NK细胞和巨噬细胞,激活细胞免疫,导致滋养层细胞凋亡与损伤,另一方面通过激活母-胎界面的血管内皮细胞促凝剂导致母体高凝状态,诱导胎盘血栓形成。这个过程可能通过上调fgl2介导产生。fgl2凝血酶原酶是最近被发现的一种促凝因子,又称为纤维白细胞素(fibroleukin),它可直接作用于凝血酶原,使其转变为凝血酶,从而启动凝血过程。有研究表明,在妊娠小鼠中加入Th1细胞因子,如TNF-a和IFN-g可导致超过80%的流产率,机理可能是通过激活fg12,导致胎盘滋养细胞纤维素增多,诱发自然流产。大量研究表明URSA患者中Th1/Th2比例失衡,Th1细胞分泌的细胞因子占导。有研究表明,URSA外周血中TNF-a、IFN-g、IL-2、TNF-b升高,围着床期子宫内膜TNF-a、IFN-g、IL-2、IL-12升高,蜕膜中IFN-g较正常妊娠明显升高。

TNF-a是Th1的代表因子,由子宫内膜上皮细胞、间质细胞、淋巴细胞分泌,在不同月经周期中含量不同,分泌晚期明显增高。体外实验表明,TNF-a可分解滋养细胞DNA,使滋养细胞变形,从而启动滋养细胞死亡程序,导致胎盘血管微血栓形成,抑制胚胎生长,IFN-g放大了这一效应。现已有研究应用TNF-a抑制剂治疗URSA,在之后的治疗章节中具体介绍。2.2.2Th2细胞

Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13等这些细胞因子对调节免疫、诱导免疫耐受有重要作用。IL-4、IL-10、IL-13抑制巨噬细胞、Th1活性。IL-10为炎性介质后产生较晚的细胞因子,局限和防止过度的免疫应答,抑制MHC-II类分子和T细胞表面协同刺激分子B-7分子的表达,抑制Th1细胞合成IL-2、IFN-g等细胞因子;在小鼠流产模型中添加IL-10可降低流产率。自年Wegmann等提出妊娠维持需母-胎界面Th2细胞占优势,大量的研究证明流产的发生与TH1/TH2比例失调有关,与之相对应的细胞因子数量和比例均有一定的改变。研究表明,URSA中外周血IL-4、IL-5、IL-6、IL-10降低,蜕膜中IL-4、IL-10降低。2.2.3Th17细胞

在年代到年代,研究者们将URSA免疫方面的原因归结为Th1/Th2平衡失调,认为Th2优势表达是妊娠成功的关键。然而部分研究表明,URP外周血中IL-4、IL-10较正常妊娠组明显升高、IFN-g明显降低,提示Th2占优势。单纯应用Th1/Th2阐述流产原因已不合适,研究者们扩展到Th1/Th2/Th17/Treg平衡方面。Th17细胞由原始CD4+T细胞分化而来,在TGF-b和IL-6共同作用下,活化的初始CD4+T细胞分化为Th17细胞,而在TGF-b单独作用下,活化的初始CD4+T细胞分化为Foxp3+Treg细胞。Th17细胞分泌IL-17、IL-22、IL-26等细胞因子。IL-17通过诱导集落刺激因子(GSF)和IL-8趋化中性粒细胞,刺激产生更多的IL-1、IL-6、IL-8、TNF-a、一氧化氮(NO)、基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinase,MMP)、GM-CSF诱导产生炎症。维甲酸相关孤核抗体gt(RORgt)是Th17细胞的特异性转录因子,Th17细胞的分化及其IL-17的表达受RORgt激活和调控,RORgt诱导编码IL-17和IL-17F细胞因子基因的表达。

越来越多的研究表明Th17细胞及其细胞因子的表达与RSA的病因相关。有研究表明,URSA患者较正常妊娠女性外周血及蜕膜中Th17细胞比例升高,血清及蜕膜中IL-17、IL-23、维甲酸相关孤核受体(RORC)mRNA明显升高。

近年来研究者们观察到不同的Th17细胞亚群,部分Th17细胞分泌IFN-g,称为Th17/Th1细胞,部分Th17细胞分泌IL-4,称Th17/Th2细胞。有研究表明,在IL-12的影响下,Th17/Th1细胞有分化为Th1细胞的趋势,而Th17/Th2细胞对妊娠的维持有利。目前关于URSA与不同Th17亚群的研究较少,有研究表明,URP胚胎着床部位的Th17/Th1细胞占优势。

2.2.4Treg细胞

CD4+CD25+Treg细胞表面高表达CD25、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)和糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)等膜分子,特征性分子标记为叉状头／翅膀状螺旋转录因子(Foxp3)。主要功能是抑制自身反应性T细胞活化,从而抑制自身免疫性疾病的形成,因此CD4+CD25+T细胞又被称为调节性T细胞(Treg)或抑制性T细胞(Ts);Treg细胞分泌IL-4、IL-10、TGF-b等细胞因子。近年来研究表明,Treg细胞参与妊娠的维持,在母-胎免疫耐受中发挥重要的作用。妊娠时外周Treg细胞特异性由外周血募集至蜕膜中,早孕期及中孕期Treg细胞明显增多,晚孕期显著下降。关于Treg细胞介导母-胎免疫耐受的机制尚不清楚,既往研究表明Treg细胞通过细胞直接接触,分泌的细胞因子、抑制树突状细胞成熟等方式参与免疫调节,近期的研究表明,Treg细胞可能通过程序性死亡受体1(PD-1)、子宫肥大细胞等途径抑制免疫活性。

有研究表明,URSA外周血、蜕膜中Treg细胞数量较正常妊娠组均明显减少,URSA中IL-17细胞/Foxp3+细胞明显升高,Treg细胞的异常可能是导致URSA原因。2.3巨噬细胞

在妊娠子宫中,巨噬细胞占CD45+淋巴细胞20%~25%,约占蜕膜细胞总数的10%,蜕膜巨噬细胞表面表达特异的分子,如CD14、CD68和HLA-DR。巨噬细胞参与妊娠的各个时期,如子宫结缔组织及血管的重塑、滋养细胞着床的调控、母-胎的免疫耐受、淋巴细胞的调节和分娩的发动。目前有研究把子宫内膜巨噬细胞分为M1型和M2型,类似Th1、Th2。M1被Th1细胞因子(IFN-g、TNF-a)或细菌产生的细菌脂多糖(LPS)激活,分泌TNF-a、IL-12等细胞因子,且诱导T细胞分化为Th1细胞,参与炎症反应。M2被Th2细胞因子(IL-4、IL-10、IL-13)激活,产生IL-10、TGF-b,产生IL-1拮抗剂等参与抗炎过程。在正常妊娠中,M2占优势,诱导免疫耐受,若M1占优势可能导致不良妊娠结局,如自然流产、早产、子痫前期等。有研究表明,URP非孕期黄体中期的子宫内膜中巨噬细胞数目增多,且巨噬细胞的含量与妊娠结局相关。但URSA中关于M1/M2的研究较少,尚需要进一步的研究。

3治疗免疫因素在URSA的发生发展中发挥重要作用,纠正Th1/Th2/Th17/Treg细胞的紊乱,调整免疫细胞、细胞因子的失衡,是降低URSA流产率的重要途径。但目前针对免疫方面的治疗尚不成熟,存在争议。3.1细心呵护及精神支持(TLC)

TLC是唯一公认的能有效提高URSA妊娠成功率的治疗。在年的一项研究中表明,对于URP给予TLC,不用其他的药物治疗,流产率为26%,而对照组流产率为51%,表明TLC明显降低URP人群的流产率。部分研究表明,TCL调整机体免疫功能,促使URSA患者的Th1类细胞因子,如INF-g、TNF-a显著降低,Th1/Th2比值明显向Th2偏移,获得良好治疗结局。TLC应包括:①建立专业的RSA门诊,提供专业的医学咨询;②给予患者心理支持;③提供便捷流畅的医患沟通途径,使患者能够及时得到帮助;④给患者充足的机会向医生倾诉自己的担忧;⑤重新树立能成功妊娠的信心;⑥早孕期应用超声等各项辅助检查,每周1次严密监测;⑦医务人员要充满关爱地对待每一个患者,绝不能没有耐心。3.2免疫治疗

URSA与母体免疫异常有关,正如我们前面所谈到的NK细胞的改变、T细胞及各种细胞因子的异常等。虽然URSA的具体免疫异常尚不清楚,但已有相关的免疫治疗。免疫治疗包括主动免疫治疗和被动免疫治疗,主动免疫治疗是淋巴细胞免疫治疗(LI),具体是采用丈夫的新鲜淋巴细胞(PLI),孕前及孕期皮内或皮下注射,但当丈夫存在传染病或其它身体疾患时,也可注射健康第三者的淋巴细胞;被动免疫治疗是静脉注射免疫球蛋白(IVIG)。3.2.1淋巴细胞免疫治疗

年,基于母体胚胎排斥理论及肾移植中淋巴细胞输入的有效性,Taylor和Faulk尝试着给予URP淋巴细胞输入的方法,开始了LI的尝试。正常的妊娠中,通过激活精子中的滋养层-淋巴细胞交叉免疫抗原(TLX),产生IgG封闭抗体,该抗体结合在滋养细胞表面Fc受体,避免胚胎遭受母体的免疫攻击。URSA中由于夫妇间HLA位点共容性增大,导致母体免疫系统对胚胎抗原无法识别,不能产生混合淋巴细胞反应封闭抗体(MLR-Bf),从而导致流产。研究表明,URP中MLR-Bf阴性率高,通过LI可产生MLR-Bf,明显降低流产率。淋巴细胞免疫治疗对母体免疫状态的调节可能是提高妊娠成功率的关键,免疫治疗可以调节体内免疫细胞、免疫因子的数量及功能,产生免疫耐受。研究证明,免疫治疗可使CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞增多,CD3+HLA-DR+T细胞、CD56+CD3-NK细胞、CD56dimCD16+NK细胞、NK细胞毒性降低;在细胞因子方面,免疫治疗后外周血IFN-g、TNF-a降低[38],IL-2、IL-12降低,IL-4、IL-10升高,使Th1/Th2趋向Th2占优势。也有研究证明免疫治疗后CD4+CD25brightTreg细胞比例明显增高,CD4+CD25brightTreg细胞促进免疫耐受的形成。对于LI的有效性及安全性存在很大的争议,部分研究认为,LI可提高URSA的妊娠结局,但也有部分研究结果与之相反。研究结果的不同在于纳入人群的选择、样本量的大小,免疫治疗方法的不同。如纳入人群是否MLR-Bf阴性,样本量过小,免疫治疗是否选用新鲜的淋巴细胞,淋巴细胞的注入途径是皮下、皮内或静脉,免疫治疗的间隔时间及次数都不相同。年CochraneCollaboration总结了~年关于LI的随机对照试验,提出LI不能降低URSA的流产率。

年一篇Meta分析提出LI可以明显提高活产率,并分析了不同LI方法及治疗人群对治疗结局的影响,提出在亚洲人群中妊娠前联合妊娠期应用低剂量淋巴细胞(10×或mL外周血)行免疫治疗,活产率提高更加显著。在年美国食品药品管理局(FDA)向医生提出警告,LI中应用的血液制品未获得FDA认可,并存在安全隐患,LI只能作为实验研究应用。因此,关于LI是否能提高URSA妊娠成功率及相关机制需要进一步的研究。3.2.2IVIG

如上所述,URSA存在着Th1/Th2/Th17/Treg细胞及细胞因子的免疫失衡,研究者们尝试使用静脉内输入免疫球蛋白治疗URSA。主要依据有2个方面:①直接的抗体作用;②免疫调节作用。研究认为,IVIG可降低NK细胞数量及毒性,调节失衡的Th17/Treg细胞,但其具体的免疫调节机制尚不清楚。部分研究表明,IVIG可显著提高URSA的妊娠成功率,但部分研究结果与之相反。鉴于IVIG价格昂贵,且有过敏、头疼、溶血性贫血等副作用的可能,IVIG的使用存在较大的争议。年CochraneCollaboration提出IVIG不能降低URSA的流产率,IVIG的有效性及安全性需要进一步研究。3.3抗凝治疗

抗凝治疗包括应用阿司匹林、普通肝素、低分子肝素等抗凝剂。如前文所述,母-胎界面免疫耐受的异常,导致血管内皮细胞促凝剂的增加,诱导胎盘血栓形成,研究者们尝试使用抗凝治疗试图改变母-胎界面的高凝状态,减少流产率。对于有抗心磷脂抗体综合征、遗传性血栓性疾病的RSA患者,研究者们认为应用抗凝剂可降低流产率。目前临床上也将抗凝治疗扩展应用到URP中,但其有效性及安全性仍存在较大争议。虽然临床上已使用阿司匹林及肝素治疗URSA,但其机理不明确,且多基于专家共识,RCTs实验较少,年的2项研究中均提示低分子肝素不能降低URSA的流产率,关于阿司匹林及联合2类抗凝药物的用药效果也存在争议,年的CochraneCollaboration报告提出,在URP中应用抗凝剂并不能提高活产率,且抗凝剂存在一定的出血风险,需要更多大样本的试验。3.4孕激素

孕激素使子宫内膜从增殖期转化为分泌期,为受精卵着床做准备,降低子宫平滑肌兴奋性及对缩宫素的敏感性,抑制子宫收缩,并可抑制子宫与胚胎之间的免疫反应,从而产生免疫耐受。一些研究认为,一些自然流产是由于体内孕激素分泌不足引起的,因此近50年来,临床上孕激素一直被广泛用来预防早中孕期的自然流产,且将孕激素应用扩展到URSA的治疗中,但一直以来孕激素对于预防自然流产及URSA均存在较大争议。年CochraneCollaboration提出孕激素并不能降低自然流产率,但在RSA人群中,可显著降低流产率,且与孕激素给药途径(口服、肌肉注射、阴道内给药)无关,年的一项包含例URSA患者的多中心大样本随机实验中,显示出应用孕激素的研究组与对照组的活产率无明显差异。孕激素在早中孕期的安全性也存在质疑,既往曾认为孕激素补充对胚胎及母体都是无害的,但也有应用孕激素后胎儿畸形的报道,如隐睾、心血管畸形等,但研究没有对照组,无法判断孕激素是否增加胎儿畸形的风险。3.5其他治疗

除了上述治疗外还有一些有争议的试验性治疗。部分研究者根据URSA患者细胞因子的失衡,TNF-a对妊娠的不良影响,将TNF-a拮抗剂应用至URSA的治疗中,并提出TNF-a拮抗剂可降低URSA流产率,但临床观察中存在发热、神经系统症状、皮疹等方面的副作用风险;另有研究表明,皮下注射G-CSF可提高URSA妊娠成功率。4结论URSA的免疫学发病机制尚不清楚,需要更多深入研究,针对母胎免疫失衡的治疗均为试验性且多有争议,需要更多的大样本随机对照试验。参考文献(略)