KeyLaboratoryofBiodiversityFormationMechanismandComprehensiveUtilizationofQinghai-TibetanPlateauinQinghaiProvince

概述

OVERVIEW

JournalofEthnopharmacology（IF=3.）上刊载了WansuPark研究团队（E-mail:pws98

前言TNTRODUCTION

黄芩(SR，唇形科黄芩的根)由于其解热、抗菌、抗病毒和抗炎的特性，长期以来在亚洲(例如，韩国、中国和日本)被用于治疗腹泻、黄疸、尿痛、高热、化脓性感染、呕血、鼻出血、血尿、子宫出血和妊娠出血。活性黄酮分离物有银杏内酯、黄芩素、汉黄芩素和汉黄芩苷等。最近的报告还表明，黄酮黄芩苷(5，6-二羟基-4氧基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-7-β-d-吡喃葡萄糖酸)可降低实验性自身免疫性脑脊髓炎的严重程度。

一氧化氮是由左旋精氨酸的胍基氮生成的活性自由基分子，被一氧化氮合酶氧化。一氧化氮是宿主对细菌、病毒、真菌和寄生虫等病原体的先天免疫反应所必需的。此外，一氧化氮在其他生理功能的调节中起着重要作用，包括神经传递、血管舒张和神经毒性。然而，过量的一氧化氮产生会导致炎症性疾病，如类风湿性关节炎和自身免疫性疾病。因此，抑制一氧化氮的产生是抗炎药物开发的主要目标。

细胞因子由多种类型细胞产生和分泌，包括巨噬细胞和单核细胞。它们在细胞间相互作用(如炎症、造血、免疫和过敏反应)的诱导和调节中起着重要作用。炎症(急性或慢性)是免疫发病机制的重要组成部分。在炎性疾病期间，巨噬细胞产生过量的细胞因子，如NO和促炎细胞因子。来源于革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖激活巨噬细胞释放几种炎症介质，包括一氧化氮、白细胞介素-6和白细胞介素-12p40。

本实验研究了SR对脂多糖诱导的RAW.7巨噬细胞中一氧化氮、白细胞介素-3、白细胞介素-6、白细胞介素-10、白细胞介素-12p40、白细胞介素-17、干扰素诱导蛋白-10、角质细胞衍生趋化因子和血管内皮生长因子产生的抑制作用。

方法METHOD

细胞生存力

细胞生存力用改良的MTT法进行评估。简而言之，将细胞(2×个细胞/孔)接种在96孔板中并用锶处理。向每个孔中加入MTT溶液(5毫克/毫升磷酸盐缓冲盐水)，并在37℃下进一步孵育4小时。随后，μL向每个孔中加入1升二甲基亚砜(DMSO)以溶解任何沉积的甲醛。用微孔板读数器在纳米处测量每个孔的光密度。

NO测定

通过格里斯反应测定培养基中一氧化氮的浓度。将每个孔的μL上清液与μL格里斯试剂(5%磷酸中含1%磺胺，水中含0.1%萘乙二胺二盐酸盐)在96孔板中混合。在室温下孵育15分钟后，用微孔板读数器在纳米处测定光密度。

多重珠基细胞因子分析

基于多重珠子的细胞因子分析使用基于xMAP技术的Luminex分析在细胞培养上清液中测量从处理的Raw.7细胞释放的细胞因子。该分析是用Bio-Plex悬浮阵列系统(Bio-Rad)和Procarta细胞因子分析试剂盒进行的。每种细胞因子的标准曲线(IL-1α、白介素-3、白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介素-9、白介素-10、白介素IL12p40、白介素-13、白介素-17、白介素-10、KC和血管内皮生长因子VEGF)使用试剂盒提供的参考细胞因子样品产生。这些实验中使用的检测方法设计用于在一个孔中用50μl样。方法如下：用洗涤缓冲液预润湿96孔过滤板后，使用真空歧管抽吸每个孔中的溶液。细胞培养上清液用实体结合珠进行30分钟的培养。孵育期后，加入检测抗体并孵育30分钟。随后，向每个孔中加入链霉亲和素-聚乙烯30分钟。用缓冲液洗涤除去未结合的链霉亲和素-聚乙烯后，在Bio-plex仪器中分析与每种细胞因子结合的珠子。使用Bio-Plex管理软件(Bio-Rad)分析原始数据(荧光强度)。没食子酸(GA，25μm)作为阳性对照。

统计分析

显示的结果是从三个独立的实验中总结出来的，并表示为平均标准差。使用方差分析和学生的t检验，用SPSS11.0软件检验显著差异。

结果RESULT.

SR对脂多糖刺激的RAW.7细胞中一氧化氮产生的影响如图2和表1所示。用不同浓度的SR(25、50、和μg/mL)和LPS(1μg/mL）24小时和48小时。脂多糖诱导的一氧化氮生成呈剂量依赖性显著增加(p0.05).

图2SR对脂多糖刺激的巨噬细胞产生亚硝酸盐的影响。通过格里斯反应试验测量一氧化氮的产生，并表示为对照的百分比(仅脂多糖)。数值是三个独立实验的平均标准差。*p0.05vsLPS(μg/mL)

SR对细胞因子产生的影响(白介素-1α、IL-3、IL-4、IL5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12p40、IL-13、IL-17、IP-10、KC、VEGF)在LPS激活的RAW.7细胞中的分布如表1和图3所示。具体来说，用不同浓度的SR(25、50、和μg/mL)和LPS(发现SR显著降低白细胞介素-3、白细胞介素-6、白细胞介素-10、白细胞介素-12p40、白细胞介素-17、白细胞介素-10、KC和血管内皮生长因子激活的小鼠巨噬细胞的产量(p0.05)。

SR含有大量黄酮衍生物，因此使其成为治疗胃肠道感染的最重要的草药之一。然而，SR对巨噬细胞分泌的促炎介质的影响尚未完全报道。在本研究中，用小鼠巨噬细胞株RAW.7研究了黄芩的抗炎作用。

SR对小鼠巨噬细胞无细胞毒性，但对脂多糖诱导的一氧化氮产生有剂量依赖性抑制作用。由于一氧化氮是一种主要的促炎介质，这些结果表明SR可能具有抗炎作用，在病理上抑制一氧化氮的产生。

白细胞介素-6最初被确定为B细胞分化因子，是一种多功能细胞因子，调节免疫反应、造血、急性期反应和炎症，其水平的升高通常与多种疾病相关，包括类风湿性关节炎、全身性幼年慢性关节炎、骨质疏松症、银屑病、多克隆浆细胞病、恶性浆细胞瘤、克罗恩病和脑脊髓炎。因此，白介素-6抑制剂可用于治疗炎性自身免疫性疾病。在目前的研究中，SR对脂多糖诱导的白细胞介素-6和白细胞介素-3的产生具有显著的剂量依赖性下调作用。因为髓样前体的分化是由白介素-3刺激的，这些结果表明SR可能具有抗炎活性。

白介素-10是调节多种适应性免疫相关细胞功能的另一种多效性细胞因子，作为免疫抑制和抗炎细胞因子受到高度重视，具有免疫刺激特性，包括激活T细胞、B细胞、NK细胞和肥大细胞。免疫相关细胞的刺激可能与炎症过程有关。在目前的研究中，发现SR以剂量依赖的方式抑制脂多糖诱导的白细胞介素10的产生。需要进一步的研究来确定SR是通过抑制白细胞介素-10的产生来抑制还是刺激炎症。细胞因子IL-12是p40和p35亚单位的异二聚体，由巨噬细胞、树突细胞和B细胞分泌。

白介素-12最显著的功能是促进幼稚T细胞的分化，产生记忆Th1对抗原刺激有反应的细胞。白介素-12p40可显著上调肿瘤坏死因子-α的表达和剂量依赖性诱导表达iNOS。此外，白细胞介素-12通过激活核因子-α上调亚硝酸盐的产生。BV-12神经胶质细胞、小鼠原代小胶质细胞和小鼠腹腔巨噬细胞中的B细胞。白介素-17促进类风湿性关节炎的炎症，血管内皮生长因子作为类风湿性关节炎的直接促炎介质。

数据表明，SR抑制脂多糖诱导的白细胞介素12p40，白细胞介素17和血管内皮生长因子的产生。这些结果假设SR可能与调节自身免疫性疾病如类风湿性关节炎有关。KC和干扰素诱导蛋白(IP)-10是趋化因子，已知被多种炎症因子上调。SR对PS诱导的kcandip-10产物具有显著的抑制作用，且呈剂量依赖性。这些结果表明SR可能有助于调节趋化因子介导的炎症。

总之，虽然调节SR抗炎活性的确切机制尚不清楚，本研究证明了SR抑制脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞中促炎介质的产生，包括一氧化氮、白细胞介素-3、白细胞介素-6、白细胞介素-10、白细胞介素IL12p40、白细胞介素-17、白细胞介素-10、KC和血管内皮生长因子。这些发现表明SR具有抗炎特性，并可能作为巨噬细胞活化的调节剂。

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